Новая модель кортикального

Научные отчеты, том 13, Номер статьи: 7809 (2023) Цитировать эту статью

1316 Доступов

5 Альтметрика

Подробности о метриках

Кортикальные органоиды человека (hCO), полученные из индуцированных человеком плюрипотентных стволовых клеток (ИПСК), предоставляют платформу для изучения механизмов развития человеческого мозга и заболеваний в сложных трехмерных тканях. Однако в современных методах разработки hCO отсутствуют важные неневральные ткани, такие как окружающий менингеальный слой, которые, как было показано, необходимы для нормального кортикогенеза и развития мозга. Здесь мы сначала создали hCO из одной розетки, чтобы создать более однородные органоиды с постоянным размером около 250 мкм к 5-му дню. Затем мы воспользовались преимуществами системы 3D-совместного культивирования, чтобы инкапсулировать органоиды мозга тонким слоем менингеальных клеток с самого начала. ранние стадии коркового развития. Анализ иммуноокрашивания проводился для выявления различных маркеров коркового слоя на разных стадиях развития. Мониторинг развития органоидов в реальном времени с помощью IncuCyte показал улучшение морфологии и увеличение скорости роста с течением времени. Мы обнаружили, что органоиды, инкапсулированные в менингеальные оболочки, демонстрируют лучшую ламинарную организацию, демонстрируя более высокую экспрессию REELIN нейронами Кахаля-Ретциуса. Наличие менингеальных клеток приводило к большему увеличению промежуточных клеток-предшественников TBR2 (IPC), глубокого кортикального слоя (CTIP2) и верхнего кортикального слоя (BRN2). Наконец, органоиды, инкапсулированные в менингеальные оболочки, усиливают образование внешней радиальной глии и астроцитов, что подтверждается более сильной экспрессией маркеров HOPX и GFAP, соответственно. Это исследование представляет собой новую платформу для совместного 3D-культурирования, которая более точно имитирует структуру коры головного мозга in vivo и позволяет нам лучше исследовать механизмы, лежащие в основе нарушений нервного развития во время эмбрионального развития.

Человеческий мозг состоит из нескольких типов клеток, включая нейроны, астроциты, микроглию и олигодендроциты. Современные церебральные органоидные системы, полученные из плюрипотентных стволовых клеток, предоставляют важные модели in vitro для повторения развивающейся коры головного мозга человека, что позволяет нам изучать развитие мозга как в здоровых, так и в болезненных состояниях1,2,3,4,5. Однако существует несколько ограничений существующих модельных систем in vitro, которые могут повлиять на их воспроизводимость и применимость. Одним из таких ограничений является вариабельность от партии к партии, которая может возникнуть из-за различий в исходных популяциях клеток, условиях культивирования и свойствах самоорганизации клеток6,7. Устранение этого ограничения имеет решающее значение для разработки органоидов как надежных моделей для изучения человеческого мозга. Внедрение подхода, основанного на одной розетке, позволило нам создать более последовательные и воспроизводимые органоиды, что привело к получению более однородных и определенных органоидов, которые лучше имитируют аспекты раннего развития мозга.

Еще одним ограничением органоидной модели является отсутствие полного клеточного разнообразия, наблюдаемого в человеческом мозге8. Хотя органоиды могут генерировать некоторые типы клеток, обнаруженные в человеческом мозге, здесь представлены не все типы клеток. Это может ограничить правильную передачу сигнала, необходимую для полного повторения аспектов развития и архитектуры человеческого мозга с соответствующей сложностью. Чтобы преодолеть это ограничение, наш подход заключается в том, чтобы включить менингеальные клетки в качестве важного типа клеток, играющих ключевую роль в развитии мозга. Мозговые оболочки, тип ненейрональных клеток головного мозга, присутствуют с самых ранних эмбриональных стадий развития коры и, по-видимому, необходимы для нормального кортикогенеза и формирования структур мозга9,10,11,12. Недавние исследования выявили непаренхиматозную нишу популяции НСК в мозговых оболочках, которая экспрессирует маркеры нейрональных предшественников, которые способны генерировать новые нейроны in vitro и in vivo13,14. Во время развития мозга мозговые оболочки играют решающую роль в развитии hCO, высвобождая различные морфогенные факторы, необходимые для кортикогенеза. Исследования in vitro показали, что менингеальные клетки могут секретировать FGF-215, IGF216,17, CXCL1218,19,20,21 и ретиноевую кислоту22,23,24, которые необходимы для правильного кортикогенеза. Исследования in vivo также продемонстрировали, что мозговые оболочки секретируют множество сигнальных молекул, в том числе Sonic hedgehog (Shh), который играет ключевую роль в развитии вентральной части переднего мозга, и семейство костных морфогенетических белков (BMP), которое регулирует дорсально-вентральную часть мозга. формирование паттерна нервной трубки25. Другие факторы, секретируемые мозговыми оболочками, включают членов семейства факторов роста фибробластов (FGF), Wnt и Notch, которые участвуют в регуляции пролиферации, дифференциации и выживания клеток в различных процессах развития, включая нейрогенез1,26,27,28, 29. Предполагается, что обогащенные ламинином участки мозговых оболочек необходимы для регуляции высвобождения этих факторов. Следовательно, наличие мозговых оболочек, по-видимому, имеет решающее значение для развития органоидов мозга30.

5 × 105 cells in 1 ml volume. HMC were characterized by immunofluorescence; they are all positive for fibronectin and negative for GFAP and α-smooth muscle actin. 5 × 105 cells/ml, were purchased (1 ml/vial) in passage zero, expanded in meningeal cell medium MenCM consisting of 500 ml of basal medium, 10 ml of fetal bovine serum and 5 ml of meningeal cell growth supplement and 5 ml of penicillin/streptomycin (ScienCell catalog #1404) medium and were used up to passage number three./p> 250 µm by day 5 (Fig. 1c). Morphological observation showed well-defined lumen structures in the middle of the rosettes (Fig. 1c, g). Overall, single rosettes had > 1.8-fold increase in size from day 3 to 5 which was shown to be significant (p < 0005). (Fig. 1f). These data were confirmed with two additional iPSC lines (PCDH19 and CHD2). Data from these two lines are shown in (Supplementary Fig. S1). To characterize neural rosette emergence, we conducted a time course analysis on different neural stem/progenitor cell (NPC) markers. Only 2 days after dual SMAD induction, iPSC-derived rosettes started to show expression of neuroectodermal markers PAX6 and NESTIN NPCs and apical membrane marker PKC-Z (Fig. 1e1). At day five, well-defined polarized neuroepithelial-like structure was observed with distinguished expression of PAX6 and NESTIN NPCs in the ventricular zone (VZ) and strong expression of adherent junction markers of N-Cadherin and PKC-Z in the apical region which resembled neural tubes (Fig. 1e2, g)./p> 800µm by day 24 (Fig. 1i). Our approach to generate cortical organoids from single rosettes appears to rapidly produce homogeneous organoids and yield well-defined organized neuroepithelial rosettes./p> 1.5-fold-change) in hCOMs compared to control hCOs (Fig. 3c). Data were analyzed from four separate experiments and a total number of 18 organoids for the CC1 cell line and results replicated with the use of two additional cell lines (PCDH19 and CHD2) in Supplementary Fig. S6. Together, these results show that our novel co-culture system using human iPSCs and meningeal cells together can efficiently enhance the morphology and phenotype of cortical organoid formation and increase their growth in a specific time course./p>

10 cortical structures from 4 independent experiments). Error bars ± SD, all scale bars: 100 µm, (c,d) representative immunostaining images for preplate Cajal-Retzius marker REELIN after 10 weeks in hCOMs and hCOs and quantification of the relative thickness of the MZ area at week 10. For each cortical structure, three measurements were taken at 45° angles to obtain the mean. MZ thickness was statistically significantly expanded after 10 weeks in hCOMs compared to hCOs (p < 0.0005) (n = 4 biological replicates in total, n = 2 CC1, n = 1 PCDH19 and n = 1 CHD2, n = 10 number of organoids were analysed). Error bars ± SD, scale bars: 100 µm./p>

3.0.CO;2-D" data-track-action="article reference" href="https://doi.org/10.1002%2F1096-9861%2820010226%29431%3A1%3C88%3A%3AAID-CNE1057%3E3.0.CO%3B2-D" aria-label="Article reference 15" data-doi="10.1002/1096-9861(20010226)431:13.0.CO;2-D"Article CAS PubMed Google Scholar /p>

Новости