Многофункциональная система для редактирования генома и больших

Nature Communications, том 13, номер статьи: 3430 (2022 г.) Цитировать эту статью

5994 Доступа

3 цитаты

28 Альтметрика

Подробности о метриках

CRISPR SWAPnDROP расширяет возможности редактирования генома до крупномасштабного переноса ДНК in vivo между видами бактерий. Его подход к модульной платформе облегчает адаптацию к конкретным видам для обеспечения редактирования генома у различных видов. В этом исследовании мы показываем реализацию концепции CRISPR SWAPnDROP для модельного организма Escherichia coli, быстрорастущего Vibrio natriegens и патогена растений Dickeya dadanii. Мы демонстрируем вырезание, перенос и интеграцию больших хромосомных областей между E. coli, V. natriegens и D. dadanii без промежуточной экстракции ДНК, ограничивающей размер. CRISPR SWAPnDROP также обеспечивает общие подходы к редактированию генома, включающие бескаркасные, безмаркерные, итеративные и параллельные вставки и делеции. Модульный характер облегчает применение библиотеки ДНК и переработку стандартизированных деталей. Его многоцветная система совместного выбора без рубцов значительно повышает эффективность редактирования и обеспечивает визуальный контроль качества на протяжении всего процесса сборки и редактирования.

В последние годы актуальность редактирования генома бактерий резко возросла в фундаментальных исследованиях, биотехнологиях и синтетической биологии. Новые технологии, такие как CRISPR/Cas9 и крупномасштабный синтез ДНК, сделали редактирование генома доступным широкому научному сообществу. Однако крупногабаритные модификации, несовместимость отдельных инструментов, а также высокопроизводительные системы по-прежнему остаются проблематичными.

Основными этапами редактирования генома бактерий является введение экзогенной матричной ДНК в виде плазмид, оцДНК или дцДНК и последующая интеграция в хромосому посредством гомологичной рекомбинации. Гомологичная рекомбинация — очень неэффективный процесс, даже если его улучшить с помощью систем рекомбинации, таких как λRED. Были разработаны различные стратегии для преодоления трудоемкого скрининга отредактированных клеток, например, интеграция маркеров устойчивости к антибиотикам или метаболических маркеров1,2,3,4. Однако количество возможных изменений в одной ячейке ограничено количеством доступных маркеров, поскольку для каждого маркера возможно только одно редактирование. Кроме того, введение дополнительных маркерных генов в хромосому может вызвать нежелательное вмешательство в соседние единицы транскрипции5,6. Чтобы обойти проблему ограничения маркеров, вводятся сайт-специфические рекомбиназы, такие как Cre- и FLP-рекомбиназа, для удаления маркера селекции после хромосомной интеграции7,8. Это добавляет дополнительный этап к процессу редактирования и оставляет в геноме активные сайты рекомбинации, что в конечном итоге ограничивает применение этого подхода даже с использованием альтернативных сайтов рекомбинации9. Другая стратегия, позволяющая избежать маркеров селекции и других рубцов, — это олигоопосредованная аллельная замена (OMAR). Короткая одноцепочечная (оц) ДНК включается в геном в результате аллельной замены, подобной Окадзаки, в репликационной вилке и способствует точечным мутациям, небольшим делециям и инсерциям10. Автоматизация и циклизация этого метода позволяют модифицировать геном нескольких генов11. Однако OMAR ограничен размером используемых олигонуклеотидов оцДНК, поэтому более крупные изменения невозможны.

Для более масштабного редактирования генома без рубцов можно применить методы встречного отбора. Такие методы основаны на эффективных контрселекторах, таких как мегануклеазы I-SceI и I-CreI, которые вводят двухцепочечные разрывы в определенном сайте длиной 18 и 22 п.н.12,13. Двухцепочечный разрыв приводит к гибели нередактированных клеток. Это сильно обогащает жизнеспособную популяцию успешно отредактированных клеток. Однако этот подход требует дополнительного классического этапа редактирования, на котором целевой сайт мегануклеазы сначала интегрируется в хромосому в интересующем участке.

Открытие CRISPR/Cas9 отменило первоначальную интеграцию определенного сайта рестрикции. Подобно мегануклеазе, Cas9 является эндонуклеазой. В отличие от мегануклеазы Cas9 не обладает специфичностью последовательности ДНК. Специфичность опосредована направляющей РНК (гРНК), комплементарной целевой последовательности. Возможные сайты-мишени ограничены только последовательностью мотива, примыкающего к протоспейсеру (PAM) (5'-NGG-3'), которая должна располагаться выше целевой последовательности. Благодаря своей простоте встречный отбор Cas9 получил широкое распространение. Плазмидные системы, содержащие индуцибельный Cas9 и систему рекомбинации, были разработаны для отбора генных делеций, точечных мутаций и коротких вставок14,15. Эти системы зависят от трансформации синтетических олигонуклеотидов или линейной двухцепочечной матричной ДНК для гомологичной рекомбинации и поэтому не подходят для вставки большого размера. Чтобы преодолеть ограничения по размеру, REXER предоставляет матричную ДНК в эписомальном репликоне16. Вставки размером до 100 т.п.н. вырезаются in vivo с помощью CRISPR/Cas9, чтобы облегчить рекомбинацию λRED. Отбор происходит с помощью маркеров положительного и отрицательного отбора, что приводит к образованию рубцов в месте интеграции и требует предварительной интеграции первого набора маркеров селекции.