Визуализация активности кишечной нервной системы с помощью красителя

Биология связи, том 6, Номер статьи: 236 (2023) Цитировать эту статью

843 Доступа

5 Альтметрика

Подробности о метриках

Значительные успехи были достигнуты в технологиях визуализации, но большинство методологических подходов, используемых в настоящее время для изучения функций кишечных нейронов, основаны на экзогенных контрастных красителях, которые могут мешать клеточным функциям или выживанию. В настоящей статье мы исследовали, можно ли использовать полнопольную оптическую когерентную томографию (FFOCT) для визуализации и анализа клеток кишечной нервной системы. Экспериментальная работа с цельными препаратами незафиксированной толстой кишки мышей показала, что FFOCT позволяет визуализировать сеть миентеральных сплетений, тогда как динамическая FFOCT позволяет визуализировать и идентифицировать in situ отдельные клетки в миентеральных ганглиях. Анализы также показали, что динамический сигнал FFOCT может быть изменен внешними стимулами, такими как вератридин, или изменениями осмолярности. Эти данные позволяют предположить, что динамическая FFOCT может представлять большой интерес для выявления изменений функций кишечных нейронов и глии в норме и при заболеваниях.

Энтеральная нервная система (ЭНС) представляет собой интегрированную сеть нейронов, присутствующую в желудочно-кишечном тракте (ЖКТ). ЭНС, состоящая из нейронов и энтеральных глиальных клеток (ЭГК), регулирует ключевые функции ЖКТ, включая моторику, секрецию слизистой оболочки, пролиферацию клеток, восстановление тканей, а также иммунные функции1. Нарушения организации и функций ЭНС способствуют возникновению различных дисфункций ЖКТ, наблюдаемых при широком спектре пищеварительных и внепищеварительных расстройств2.

За последние годы были разработаны методы микроскопической визуализации, позволяющие лучше понять функции ЭНС в нормальных и аномальных условиях. Например, прогресс был достигнут за счет сочетания микроскопических методов высокого разрешения с флуориметрическими зондами, такими как чувствительные к кальцию или чувствительные к напряжению красители3. Понимание организации и сосудистой системы ЭНС также было обеспечено с помощью таких технологий, как световая микроскопия и оптическая проекционная томография, которые позволяют анализировать срезы иссеченной пищеварительной ткани площадью в несколько квадратных сантиметров4,5. Однако эти технические подходы могут быть реализованы только ex vivo, поскольку они требуют очистки тканей и иммуногистохимического окрашивания. Визуализация ЭНС человека in vivo была достигнута с помощью зондовой конфокальной эндомикроскопии (pCLE), но поскольку разрешение и глубина проникновения были слишком низкими, для получения четкого изображения ЭНС7 потребовалось эндоскопическое рассечение подслизистой оболочки6 или окрашивание крезиловым фиолетовым6. В этом контексте большой интерес представляют новые технологии, обеспечивающие высокое пространственное разрешение и динамическую визуализацию ЭНС без красителей.

В этом отношении оптическая когерентная томография (ОКТ) может быть очень полезна, поскольку она позволяет получать изображения внутренних структур тканей путем интерферометрического анализа обратнорассеянного и отраженного света8. Эта высокоскоростная и неинвазивная технология основана на естественном контрасте тканей для создания объемной реконструкции ткани. Эта стратегия визуализации наиболее широко используется для диагностики заболеваний человеческого глаза9, но в сочетании с оптоволоконным датчиком ОКТ может получать изображения сердечно-сосудистой, дыхательной или пищеварительной системы10. В кишечнике эндоскопическая ОКТ обычно используется для диагностики пищевода Барретта11, а предварительные данные были получены и по другим показаниям, таким как воспалительные заболевания кишечника и колоректальный рак12,13. Эндомикроскопическая ОКТ in vivo с типичным разрешением в десятки микрон14 имеет слишком низкое разрешение для визуализации ЭНС, но более высокое разрешение можно получить с помощью двух реализаций этого метода: FFOCT15,16 и SD-OCT высокого разрешения17,18,19. В этой статье мы представляем результаты, полученные с помощью FFOCT, который получает 2D-изображения лицевой стороны с использованием объективов с высокой числовой апертурой и видимого света. Это позволяет генерировать изображения с микрометрическим и субклеточным разрешением, а также можно собирать объемные данные, изменяя глубину получения ОКТ-изображения анфас. Его применение в основном изучалось для внутрипроцедурного обнаружения границ опухоли в различных органах20, включая мозг21. Также сообщалось о том, что он позволяет визуализировать структуры глаза22,23. Несмотря на некоторые предпринятые ранее усилия24, разработка эндоскопической версии FFOCT до сих пор не была достигнута. В образцах кишечника ex vivo FFOCT продемонстрировал свою способность отображать межмышечные сплетения в желудочно-кишечном тракте мыши и человека25. Однако этот метод визуализации не визуализирует нейроны и глиальные клетки кишечных ганглиев, отчасти из-за сильных сигналов обратного рассеяния, производимых окружающими тканями, такими как мышечные клетки, или ЭНС, а также наличием спекл-шума. Новый инструмент под названием динамическое FFOCT (D-FFOCT) значительно улучшил клеточный контраст в сложных тканях за счет анализа временных колебаний обратно рассеянного света от тканей и клеток26. Для временного анализа микродвижения компонентов клеток, который лежит в основе внутреннего контраста D-FFOCT, сигналы ОКТ собираются с течением времени из одной и той же плоскости изображения, что, в свою очередь, также уменьшает дополнительный шум и улучшает качество изображения. Динамический контраст был также реализован в технологии SD-OCT высокого разрешения, которая обеспечивает изображения поперечного сечения ткани по сравнению с плоскостью изображения лицевой стороны D-FFOCT27. Микро-ОКТ с динамическим контрастом использовалась для визуализации микроанатомии дыхательных путей28, шейки матки и пищевода29. Недавние усилия направлены на дальнейшее улучшение скорости получения и качества изображений D-FFOCT и микро-OCT с динамическим контрастом для обеспечения визуализации in vivo30,31,32. В то же время технология микро-ОКТ была успешно преобразована в эндоскопическую конструкцию33,34. Был представлен предварительный дизайн микро-ОКТ-эндоскопа с динамическим контрастом, но проблема стабилизации тканей во время длительного сбора данных, необходимая для извлечения динамического контраста, остается основным ограничением. Клеточные механизмы, лежащие в основе временных колебаний сигналов ОКТ, также остаются неизвестными, но изменения в клеточной метаболической активности могут быть частично ответственными, поскольку ингибирование митохондриальной активности с помощью ротенона или гликолиза с использованием 2-дезокси-D-глюкозы значительно снижает интенсивность сигнала ОКТ26. Интересно, что отдельные эпителиальные или иммунные клетки, которые нельзя было идентифицировать индивидуально с помощью FFOCT, можно было визуализировать с помощью D-FFOCT36. Это обнадеживает, но на сегодняшний день ничего не известно о способности D-FFOCT отображать ЭНС или биологические механизмы, лежащие в основе сигналов D-FFOCT от клеток ЭНС.