Ландшафт убиквитинирования полимеразы вируса гриппа А

Nature Communications, том 14, номер статьи: 787 (2023) Цитировать эту статью

3630 Доступов

1 Цитаты

188 Альтметрика

Подробности о метриках

Во время инфекций вирусом гриппа А (IAV) вирусные белки подвергаются воздействию клеточных лигаз Е3 для модификации убиквитином. Здесь мы расшифровываем и функционально исследуем ландшафт убиквитинирования белков полимеразы IAV во время инфекции альвеолярных эпителиальных клеток человека, применяя масс-спектрометрический анализ иммуноочищенных пептидов, несущих K-ε-GG (ди-глицил)-остаток. Мы идентифицировали 59 модифицированных лизинов в трех субъединицах вирусной полимеразы PB2, PB1 и PA, из которых 17 особым образом влияют на транскрипцию мРНК, репликацию вРНК и генерацию рекомбинантных вирусов посредством непротеолитических механизмов. Более того, дальнейший функциональный анализ и анализ in silico показывают, что убиквитинирование по K578 в домене большого пальца PB1 механически связано с динамическими структурными переходами вирусной полимеразы, которые необходимы для репликации вРНК. Мутации K578A и K578R по-разному влияют на образование рекомбинантных вирусов, препятствуя синтезу кРНК и вРНК, связыванию NP, а также димеризации полимеразы. В совокупности наши результаты показывают, что убиквитин-опосредованная нейтрализация заряда в PB1-K578 нарушает взаимодействие с неструктурированной петлей на N-конце PB2, которая необходима для координации димеразы полимеразы и облегчения репликации вРНК. Это доказывает, что IAV использует клеточную систему убиквитина для модуляции активности вирусной полимеразы для репликации вируса.

Вирусы гриппа А (IAV) представляют собой респираторные патогены семейства Orthomyxoviridae, которые представляют существенную угрозу глобальному здоровью в результате сезонных эпидемий и повторяющихся пандемий. Геном IAV состоит из восьми сегментов одноцепочечной РНК с отрицательным смыслом (вРНК). Каждая вРНК инкапсидирована множеством копий нуклеопротеина (NP) и одной копией тримерной вирусной РНК-зависимой РНК-полимеразы (RdRP), состоящей из субъединиц PB2, PB1 и PA1,2, с образованием комплексов вирусных рибонуклеопротеинов (vRNP)3. Транскрипция вирусных мРНК и репликация вирусного генома опосредуются RdRP и происходят в ядре клетки. Хотя поступающие вРНП способны напрямую осуществлять синтез мРНК после захвата кэпа из пре-мРНК, полученных из хозяина4,5,6, репликация вРНК зависит от вновь образующихся вирусных белков и полимеразных комплексов. Он протекает независимым от праймера способом, который включает в себя генерацию полноразмерных промежуточных комплементарных РНК (кРНК), которые служат матрицами для синтеза вРНК7.

Структурные исследования показали, что IAV RdRP представляет собой гибкий и высокодинамичный белковый комплекс, который принимает различные конформации во время транскрипции мРНК и репликации вРНК5,8. Текущая модель репликации вРНК предполагает, что переходу от транскриптазы к репликазе способствует взаимодействие со второй вирусной полимеразой, образующей асимметричный димер9,10. Более того, образование асимметричного димера облегчает инкапсидацию образующейся цепи кРНК. На втором этапе репликации генома инициация синтеза вРНК из матриц кРНК требует образования симметричного димера полимеразы посредством взаимодействия с транс-активирующей полимеразой11,12. Для поддержания оптимального баланса между транскрипцией мРНК и репликацией вРНК во время жизненного цикла вируса хронологическая сборка двух димеров имеет решающее значение, и предполагается, что на нее влияют как вирусные, так и клеточные факторы. В частности, опосредованные хозяином посттрансляционные модификации (PTM) вирусных белков были предложены в качестве динамических молекулярных переключателей для точной настройки действия RdRP13,14. Действительно, фосфорилирование15,16,17,18,19, АДФ-рибозилирование или ацетилирование19,20,21, а также связывание убиквитина (UB)22,23,24,25,26,27,28,29,30,31 и Сообщалось о убиквитиноподобных модификаторах (UBL), таких как SUMO 1–332,33, NEDD834 или ISG1535, к субъединицам полимеразы и NP. Среди этих модификаторов убиквитинирование является наиболее распространенным в клетках человека и регулирует функциональность и долговечность широкого спектра белков и было описано для всех субъединиц IAV RdRP с как про-, так и противовирусными эффектами. Сопряжение PTM, таких как UB, дает несколько эффектов. Он создает поверхность связывания для других UBL-связывающих белков, но также может экранировать сайты связывания белков на модифицированном белке. Кроме того, UB передает биологические сигналы, например, деградацию клеточной протеасомой или транслокацию в другой клеточный компартмент. Менее известным последствием UB-связывания является нейтрализация положительного заряда в боковой цепи акцептора лизина путем образования дипептидной связи, что может приводить к структурным изменениям и влиять на взаимодействие с другими белками36. До сегодняшнего дня биологическое влияние сайт-специфических модификаций белков-полимераз IAV на процессы транскрипции вирусной мРНК и репликации генома оставалось в значительной степени неизвестным.